Индустрия спорта – активность без границ.

Для консультации со специалистом выберите Ваш регион:
Большой Урал Дальний Восток Поволжье
Северо-Запад Pеспублика Саха Якутия Украина
Сибирь Центр Казахстан
Восточная Сибирь Юг  

Мы готовы к сотрудничеству
с клиентами из стран ближнего и дальнего зарубежья

Кристаллическая структура Bax, связанная с пептидом BH3 Bim, идентифицирует важные контакты для взаимодействия

  1. Результаты
  2. Роль остатков BimBH3 'h0' в активации Bax
  3. Различия в связывании BimBH3 и BidBH3 с BaxΔC21
  4. Сравнение комплексов BimBH3 с Bax и Bcl-xL
  5. Комплексы BH3mini с BaxΔC26 и BaxΔC28
  6. BidBH3: BaxI66AΔC21
  7. обсуждение
  8. Мотив «h0» и относительные потенции Bim и Bid для BaxΔC
  9. Внутренние полости
  10. Сравнение с BimBH3, связанным с Bcl-xLΔC
  11. Материалы и методы
  12. Подготовка димера ядра / защелки
  13. Переплет
  14. Липосомы
  15. Цитохром с релизом
  16. Кристаллизация, сбор и обработка данных
  17. кристаллография
  18. Таблица 1

Внутренний путь к апоптозу регулируется взаимодействиями между членами трех фракций семейства белков Bcl-2: белками, содержащими только BH3, такими как Bim и Bid, которые инициируют процесс, основными эффекторами Bax и Bak и членами, способствующими выживанию, которые выступают против действий обеих других фракций. 1 Взаимодействия между членами семейства Bcl-2, способствующими выживанию, и пептидами BH3 были хорошо охарактеризованы как самые ранние исследования с Bcl-xL и пептидом BakBH3. 2 Такие комплексы легко образуются в растворе путем инкубации усеченного на C-конце (ΔC) просурвивающего белка Bcl-2 с пептидом BH3. Отсутствие С-концевого сегмента, который может закреплять белок Bcl-2 в мембране, по-видимому, мало влияет на последующий комплекс. Считается, что этот комплекс отвечает за антиапоптотическую функцию Bcl-2 путем секвестрации мотива BH3 либо из так называемых белков BH3, таких как Bim («режим 1»), либо из Bax или Bak («режим 2»). «). 3

Хотя проапоптотические Bax и Bak имеют очень похожие трехмерные структуры с их родственниками, пережившими выживание, 4 , 5 , 6 до не давнего времени 7 , 8 не было обнаружено структуры комплекса Bax или Bak с пептидом BH3, несмотря на накопление свидетельств того, что Bax и Bak могут быть активированы напрямую путем взаимодействия с белками BH3, содержащими только BH3, Bid, Bim и, возможно, другими. 9 , 10 , 11 , 12 , 13

В отличие от Bak, который закреплен в митохондриальной наружной мембране (MOM) посредством своего C-концевого сегмента, Bax в значительной степени является цитозольным в здоровых клетках и накапливается в MOM только после сигнала смерти. 14 , 15 Там, как полагают, отображаются как минимум два разных конформера, 16 , 17 один слабо связан с MOM и другой, в котором его мембранный якорь (спираль α 9) вставлен в MOM. В противоположность антиапоптотическим родственникам Bcl-2, конструкция Bax, лишенная своего C-концевого мембранного якоря, BaxΔC21, не имеет измеримого взаимодействия с пептидами BH3. Однако в присутствии детергента связывание октилглюкозида детектируется поверхностным плазмонным резонансом (SPR) для пептидов BH3 самого Bim, Bid, Bak и Bax с IC50 в диапазоне 0,1–1 мкМ, 7 , 18 примерно в 100 раз слабее по сравнению с теми, которые измеряются аналогично (например) Bcl-xLΔC, где моющее средство не требуется. Более слабые взаимодействия между BidBH3 или BimBH3 и BaxΔC по сравнению с Bcl-xLΔC не противоречат различным моделям функции семейства белков Bcl-2, в соответствии с которыми молекулы выживающего связывают мотивы BH3 с высокой аффинностью и длительным периодом полураспада, но проапоптотически Bax и Бак активируются переходными («беги и беги») взаимодействиями с мотивами BH3. 19 , 20 , 21

Комплексы BaxΔC21, связанные с пептидами BH3 из Bid и Bax, были получены путем совмещения белка с CHAPS и избытком пептидов. 7 В этих условиях белок претерпевает конформационные изменения и димеризуется в результате перестановки доменов спиральных сегментов α 2– α 5 и α 6– α 8, названных доменами «core» и «latch» соответственно. Хотя этот «димер ядра / защелки» считается артефактом in vitro , его образование является диагностическим для разделения ядра и защелки, которое требуется для того, чтобы Bax-связанный с мембраной димеризовался через свои основные домены, а затем проникал в MOM. 7 Если домен защелки отсутствует, как в рекомбинантной конструкции GFP, слитой с Bax α 2– α 5, основной домен образует BH3: симметричные димеры с бороздками, 7 что, в соответствии с широким объемом доказательств, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 присутствуют в апоптотических порах.

Предыдущая работа 7 подчеркнул важность двух гидрофобных «h0» остатков () в пептиде (I82 / I83 в BidBH3) в управлении способностью Bid активировать Bax. Подобно Bid, Bim также является сильным прямым активатором Bax, а аминокислоты 'h0' в Bim - пролин и глутаминовая кислота. В отсутствие структуры BimBH3: BaxΔC оставалось неясным, как эти остатки 'h0' были размещены. Здесь мы опишем кристаллические структуры 26- и 20-мерных пептидов BimBH3, связанных с BaxΔC26. Сравнение со структурой BidBH3: BaxΔC21 позволяет анализировать критические контакты между этими двумя пептидами и BaxΔC. Профили связывания мутантных пептидов BH3 показывают, что связывание BimBH3 с Bax меньше зависит от остатков 'h0' по сравнению с таковым в случае BidBH3. Комплекс BimBH3 имеет аналогичную полость, прилегающую к Bax α 1, α 2, α 5 и α 8, как видно из комплекса BidBH3. Мы также описываем структуру BidBH3, связанную с мутантом BaxΔC21, I66A, который более типичен для BH3-сигнатуры антиапоптотических белков семейства Bcl-2. 7 , 26

Внутренний путь к апоптозу регулируется взаимодействиями между членами трех фракций семейства белков Bcl-2: белками, содержащими только BH3, такими как Bim и Bid, которые инициируют процесс, основными эффекторами Bax и Bak и членами, способствующими выживанию, которые выступают против действий обеих других фракций

BimBH3 связывает BaxΔC. ( а ) пептидные последовательности BH3, использованные в этом исследовании, с указанием 5 гидрофобных аминокислотных положений «h0» - «h4». ( b ) Димер ядра / защелки BaxΔC26, связанный с BimBH3. Два полипептида Bax, показанные здесь в виде мультфильмов, окрашены в желтый и серый цвета, а два пептида Bim - голубой и оранжевый. Ось симметрии кристаллографической диады проходит через центр этой частицы. ( c ) Структура комплекса BimBH3: BaxΔC26. Изображенная глобулярная единица включает остатки Bax 1–128 от одного полипептида и 129–166 от другого вместе со связанным пептидом Bim. Bax представлен его поверхностью и цветовой кодировкой в ​​соответствии с поверхностным зарядом (синий, положительный потенциал (4 кТ / е ); красный, отрицательный потенциал (-2 кТ / е ); рассчитан с использованием адаптивного решателя Пуассона – Больцмана. 41 След пептида Bim (голубой) показан с помощью «h0» (P144, E145), «h1» (I148), «h2» (L152), «h3» (I155) и «h4» (F159), представленных как палочки. ( d ) Наложение BimBH3: BaxΔC26 с BidBH3: BaxΔC21 (PDB: 4BD2). Структуры представлены в виде мультипликационных лент, желтых для Bax в комплексе Bim и пурпурных для Bax в комплексе Bid. Пептиды (Bim Cyan и Bid Blue) стоят вертикально на переднем плане в этом виде (аналогично), с их N-концами в нижней части фигуры

Результаты

BimBH3: кристаллическая структура BaxΔC26

Активация BaxΔC21 пептидами BimBH3 или BidBH3 () в присутствии CHAPS дает димер ядра / защелки BaxΔC21, 7 который может быть очищен с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Комплексные кристаллы BidBH3: BaxΔC21 затем получали путем дополнения димера избытком пептида BidBH3 перед кристаллизацией. Полученная структура содержала димер core / latch в комплексе с двумя пептидами BidBH3. 7 Хотя этой стратегии не удалось получить кристаллы BimBH3: BaxΔC21, мы отметили, что С-конец конструкции BaxΔC21 был разупорядочен в ранее опубликованных структурах (коды PDB 4BD2 и 4BD6). Поэтому вместо этого мы создали комплекс с конструкцией BaxΔC26, который кристаллизовался в условиях, отличных от тех, которые использовались для комплекса BidBH3: BaxΔC21. Решенная структура обнаружила половину димера ядро-защелка и один пептид BimBH3 в асимметричной единице (), аналогично таковым у комплексов BaxΔC21 с BaxBH3 и BidBH3. 7

Выравнивание глобулярного объекта, включающего остатки Bax 10–128, пептид Bim и остатки Bax 129–166 из полипептида-партнера в димере core / latch с сопоставимой структурой BidBH3: BaxΔC21 (код PDB 4BD2), показывает, что пептид BimBH3 входит в зацепление каноническая пептидсвязывающая борозда BaxΔC () и то, что структуры BaxΔC в двух комплексах практически идентичны (). Однако F30 в ядре белка Bax демонстрирует разные конформации в двух комплексах. В комплексе BimBH3 его фенильное кольцо имеет повышенные В- факторы. Немоделированная разность электронных плотностей, прилегающих к F30 в комплексе BimBH3, позволяет предположить, что эта аномалия обусловлена ​​различными условиями кристаллизации, используемыми для двух комплексов (см. Материалы и методы), а не следствием различий между последовательностями Bim и BidBH3. Небольшой сдвиг в положении спирали Бакса α 3 между двумя структурами () может быть из-за контактов между Bim W147 и Bax M79. С-конец BaxΔC26 (G166) виден вместе с одним остатком от вектора (серин), тогда как C-концевые остатки 168–171 BaxΔC21 в комплексе BidBH3 разупорядочены. 7 Пептиды Bim и Bid различаются по длине (), но структуры спиральных сегментов из остатков 'h0' - 'h4' находятся в тесном выравнивании. С-концевые остатки бимского пептида (–R – R–) разупорядочены.

Роль остатков BimBH3 'h0' в активации Bax

Аланиновые замены в положении 'h0' в BidBH3 (I82 / I83) () устраняют его способность связывать BaxΔC21 в анализах SPR, запускать образование димеров ядра / защелки BaxΔC21 и проницаемость липосом, подвергшихся действию полноразмерного Bax. 7 Первый из 'h0' остатков BimBH3, P144, делает такие же гидрофобные контакты с Bax, как и его аналог I82 в BidBH3. Алкильный фрагмент остатка BimBH3 E145 занимает то же место, что и остаток BidBH3 I83, но его карбоксилатный фрагмент не образует типичную пару водородных связей с гуанидином Bax R94 (). Важность остатков 'h0' BimBH3 во взаимодействии с Bax была исследована методом мутагенеза. 7 Мы проверили способность 'h0' мутантов BimBH3 запускать образование димера core / latch BaxΔC21 или связываться с BaxΔC21. Мутанты BimBH3 E145A и E145D были менее способны димеризовать BaxΔC21 () и показали пониженное связывание с BaxΔC21 в анализах SPR (). Активность двойного мутанта BimBH3 P144A / E145A значительно не снижалась. Мутант E145K с заменой заряда BimBH3 был наиболее хромым из протестированных, снижая димеризацию BaxΔC21 на> 50% () и более слабо связываясь в 40 раз с BaxΔC21 (IC50 2,4 мкМ) (). Таким образом, в отличие от мутации BidBH3 с потерей функции I82A / I83A, у BimBH3 мутант P144A / E145A нарушен лишь незначительно.

Таким образом, в отличие от мутации BidBH3 с потерей функции I82A / I83A, у BimBH3 мутант P144A / E145A нарушен лишь незначительно

Размещение E145 в позиции «h0» BimBH3. ( а ) Увеличение в области остатка Bax R94. ( б ) Профили гель-фильтрации BaxΔC, обработанного (или нет) вариантами CHAPS и BimBH3. Только мутант E145K с замененным зарядом BimBH3, по-видимому, серьезно скомпрометирован в своей способности разблокировать Bax и способствовать образованию димера ядро ​​/ защелка. ( c ) SPR-измерения мутантных пептидов BimBH3 и BimBH3, вытесняющих BaxΔC из чипа BimBH3. Полученные значения IC50 сведены в таблицу

Различия в связывании BimBH3 и BidBH3 с BaxΔC21

Далее мы сравнили структуры BimBH3: BaxΔC26 и BidBH3: BaxΔC21 (код PDB 4DB2), чтобы идентифицировать пептид-белковые взаимодействия, специфичные для любого комплекса. Одно существенное структурное различие заключается в положении «h2 + 1», R153 в Bim и A91 в Bid (). В сложной структуре BimBH3 (левая панель) Bim R153 образует плоскую стопку, 27 с сетью взаимодействий, образованной Bim D157, Bax R109 и Bax D102. Bim R153 также водородно связан с Bax S101 и основной карбонильной группой Bax D97 и M98. В сложной структуре BidBH3 (правая панель) Bid A91 не может формировать аналогичные взаимодействия.

В сложной структуре BidBH3 (правая панель) Bid A91 не может формировать аналогичные взаимодействия

Сравнение комплексов BimBH3 и BidBH3 с BaxΔC. ( a ) BimBH3: BaxΔC26 (слева) и BidBH3: BaxΔC21 (PDB: 4BD2, справа), показывающий взаимодействия между Bim R153 (оранжевая боковая цепь) и Bax, которые отсутствуют в комплексе Bid, где пептидный остаток «h2 + 1» представляет собой A91. ( b ) Измерения SPR BimBH3, BidBH3 и мутантных пептидов, вытесняющих BaxΔC из чипа BimBH3. Полученные значения IC50 сведены в таблицу. ( c ) Пермеабилизация липосом полноразмерным Bax в ответ на BimBH3, BidBH3 и мутантные пептиды (столбцы ошибок представляют SD трех независимых экспериментов. * P <0,05 и ** P <0,005. ( d ) Анализы высвобождения цитохрома с не отражают пятикратное различие в связывании с панели B. BidBH3 A91R был в лучшем случае незначительно более эффективным, чем BidBH3, по высвобождению цитохрома с из митохондрий, выделенных из MEF, экспрессирующих BaxS184L. Аналогично, BimBH3 R153A демонстрирует очень небольшое снижение активности по сравнению с BimBH3 при высвобождении цитохрома с из MEF. отображение Bax. Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов

Чтобы определить, влияет ли положение «h2 + 1» на связывание BimBH3 или BidBH3 с BaxΔC21, мы проверили активность мутантных пептидов BH3 BimBH3 R153A и BidBH3 A91R. На их способность к димеризации BaxΔC21 практически не влияли (данные не показаны). В анализе SPR () BimBH3 связывал BaxΔC21 примерно в пять раз более плотно, чем BidBH3, а мутант BimBH3 R153A вел себя как BidBH3, тогда как мутант BidBH3 A91R вел себя подобно BimBH3. В анализах проницаемости липосом () BimBH3 обладал большей способностью активировать Bax по сравнению с BimBH3 R153A, тогда как BidBH3 A91R обладал повышенной активностью по сравнению с BidBH3. Чтобы проверить, влияет ли это изменение аффинности связывания на апоптотическую активность, мы оценили способность каждого пептида индуцировать высвобождение цитохрома с из митохондрий, выделенных из эмбриональных фибробластов мыши Bak - / - Bax - / -, эктопически экспрессирующих митохондриально нацеленный вариант Bax BaxS184L , 28 Тенденции, наблюдаемые в анализе липосом, не были очевидны в этих экспериментах по высвобождению цитохрома с (), возможно, из-за ограничений экспериментальной чувствительности. Присутствие эндогенных белков выживания в эксперименте, возможно, также повлияло на результат.

Сравнение комплексов BimBH3 с Bax и Bcl-xL

Структура BimBH3: Bcl-xLΔC29 была согласована со структурой Bax-фрагмента BimBH3: BaxΔC26 (). Пептид BimBH3 является спиральным до остатка Y163, как ранее наблюдалось в комплексах BimBH3 с просурвивающими молекулами. 29 , 30 , 31 Как сообщалось ранее из аналогичного сравнения BidBH3: BaxΔC21 и BimBH3: Bcl-xLΔC7, пептид Bim в Bax смещен на ~ 1,6 Å в направлении своего С-конца относительно его положения в просвивальном белковом комплексе. Еще одна особенность этого выравнивания, согласующаяся с нашим более ранним анализом, заключается в том, что Bax 2 и 3 с правой стороны пептида более отдалены от пептида по сравнению с их аналогами из белков, способствующих выживанию. В частности, в комплексе BaxΔC остатки Bim 'h2' (L152) и 'h3' (I155) связываются только аминокислотами Bax L70 и L76 из α 2 и α 3, тогда как в комплексе Bcl-xLΔC по меньшей мере пять аминокислот кислоты (F97, Y101, A104, F105 и L108) из 2 и 3 Bcl-xL участвуют во взаимодействиях с этими двумя остатками Bim. Отметим также, что остаток B15B3 'h4' F159 принимает разные ротамеры в двух комплексах (), в случае, когда Bax осуществляет стековое взаимодействие с I66, а в случае Bcl-xL - краевой контакт с A93.

Отметим также, что остаток B15B3 'h4' F159 принимает разные ротамеры в двух комплексах (), в случае, когда Bax осуществляет стековое взаимодействие с I66, а в случае Bcl-xL - краевой контакт с A93

Сравнение связывания BimBH3 с просурвивающими и проапоптотическими белками семейства Bcl-2. ( а ) Выравнивание BimBH3: Bcl-xLΔC (оранжевый / темно-зеленый) с BimBH3: BaxΔC26 (голубой / желтый). ( б ) Деталь с панели ( а ) Bim F159 в двух комплексах, показывающая также A93 от Bcl-xL и I66 от Bax. Цветовой код, как на панели ( а ). ( c ) Полость (оранжевая) в комплексе BidBH3mini: Bax. ( d ) Полость в BimBH3mini: комплекс Bax

Комплексы BH3mini с BaxΔC26 и BaxΔC28

Ранее мы показали, что мотивы mini-BH3, состоящие из 20-членных остатков «h0» - «h4», достаточны для запуска диссоциации BaxΔC в области core и latch доменов. 7 Чтобы подтвердить, что N- и C-концевые сегменты более длинных пептидов не влияли на взаимодействие пептидов с Bax, мы кристаллизовали как BimBH3mini, так и BidBH3mini с BaxΔC26. Эти структуры в основном идентичны описанным выше и BidBH3: BaxΔC21 (PDB 4BD2 7 ), за исключением того, что следует отметить, что в случае комплекса BimBH3mini четкая плотность не очевидна для F159 (остаток 'h4'). В то время как в структуре BidBH3: BaxΔC21 C-конец пептида пассивно согнут назад (код PDB 4BD2), использование более короткого пептида оставляет верхнюю часть канавки (между спиралями Bax α 2, α 5 и α 8) открытой. Отметим также, что конформация F30 в комплексе BimBH3mini: BaxΔC26 напоминает то, что обнаружено во всех комплексах BidBH3 с Bax, которые мы изучали, что также позволяет предположить, что измененная ориентация этого остатка в структуре BimBH3: BaxΔC26 проистекает из различных условий кристаллизации. ,

Комплексы BH3mini: BaxΔC26 содержат полость между спиралями α 1, α 2, α 5 и α 8 (в форме боковых цепей остатков 26, 30, 60, 63, 66, 67, 110, 111, 114, 115, 158 и 161) как наблюдалось также в комплексе BidBH3: BaxΔC21, но не в дипере ядра / защелки apo BaxΔC21. 7 Объемы полости, рассчитанные на сервере CASTp, 32 соответственно 123 Å 3 и 111 Å3 в BidBH3mini: BaxΔC26 () и BimBH3mini: BaxΔC26 (), аналогичные по размеру полости BidBH3: BaxΔC21 140Å. 3

Чтобы исследовать последствия удаления α 8, предположительно раннего события в разделении доменов ядра и защелки, мы кристаллизовали комплекс BimBH3mini: BaxΔC28 и определили его структуру. Усечения С-конца, которые удаляют больше α 8, не могут быть выражены. 7 Хотя никаких существенных различий в способе взаимодействия пептида с белком не наблюдалось, отсутствие F165 из Bax в структуре BimBH3mini: BaxΔC28 позволяет Bax α 2 двигаться в направлении α 8 на величину до 1Å (.) Это движение Bax α 2 частично заполняет полость, наблюдаемую в комплексах BaxΔC26, описанных выше.

) Это движение Bax α 2 частично заполняет полость, наблюдаемую в комплексах BaxΔC26, описанных выше

Взаимодействие спиралей 2 и 8 в комплексах пептид: Bax. ( a ) Наложение BimBH3mini: BaxΔC26 (желтый) и BimBH3mini: BaxΔC28 (фиолетовый), показывающее коллапс спирали 2 против усеченной спирали 8 Bax. ( b ) Наложение BaxI66A (лосось) и Bax дикого типа (розовый), связанных с BidBH3. Указаны расстояния между атомами C α остатков Bax I / A66 и остатка Bid M97.

BidBH3: BaxI66AΔC21

Более ранняя работа продемонстрировала, что BidBH3 M97 связывается с Bax I66, и мутанты аланина в одном или обоих из этих положений снижают способность пептида высвобождать основной домен из домена-защелки. 7 Чтобы выяснить, был ли этот контакт ответственен за видимое внешнее смещение Bax α 2 в его комплексе с пептидами BH3 относительно положения Bcl-xL α 2 в эквивалентных комплексах, мы кристаллизовали димерный комплекс ядро-защелка BaxI66AΔC21 с BidBH3. Эта структура очень похожа на комплекс дикого типа, наибольшее отличие состоит в том, что С-конец пептида Bid неупорядочен в кристалле, а не сворачивается обратно через Bax I66A, как это происходит с Bax I66. Кроме того, небольшое «коллапс» Bax α 2 в направлении ядра комплекса () проявляется в сокращении на 1 Å расстояния между атомами C α Bid M97 и Bax I66A (8,2 Å) по сравнению с Bax I66 (9,3 Å). Как следствие, полость в структуре BidBH3: BaxI66AΔC21 уменьшается до размера, значительно меньшего, чем полости, найденные (например) внутри комплекса между BimBH3 и Bcl-xL.

обсуждение

В предыдущей работе мы описали взаимодействие между BaxΔC21 и пептидами BidBH3 и BaxBH3. 7 Кристаллические структуры этих комплексов содержали димеры core / latch BaxΔC21 с одним пептидом BH3, связанным с каждой из канонических BH3-связывающих бороздок в димере Bax. Структуры привели к осознанию важности гидрофобных аминокислот в так называемом положении «h0» в последовательности BH3, наблюдению внутренних полостей внутри структур и другим отличительным признакам комплексов пептидов BH3 с Bax по сравнению с Просурвивал членов семьи Bcl-2. Однако в этом исследовании отсутствовала структура важного активатора BH3-only белка Bim в комплексе с BaxΔC.

Мотив «h0» и относительные потенции Bim и Bid для BaxΔC

'H0' остатки Bim менее важны для активации Bax по сравнению с их аналогами в Bid. Двойной мутант P144A / E145A имеет ~ 3-кратную потерю аффинности к BaxΔC, тогда как двойной мутант Bid I82A / I83A не смог связываться с BaxΔC в нашем анализе. 7 Структуры, о которых здесь сообщается, также определяют роль остатка «h2 + 1» в мотиве BH3 в определении разницы в сродстве пептидов Bim и BidBH3 к BaxΔC21. Этот остаток в Bim (R153) делает несколько дополнительных взаимодействий с BaxΔC21 в области петли α 4– α 5 и объясняет ~ 5-кратное более тесное связывание BaxΔC21 с BimBH3, чем с BidBH3. Сообщалось о различиях в эффективности этого порядка для Bax- и Bid-индуцированной активации Bax, 33 и мы наблюдали похожие различия в анализах связывания Bax, о которых сообщалось здесь. Однако это различие не приравнивается к значительному различию в способности Bid или Bim преимущественно индуцировать Bax-опосредованную проницаемость митохондрий (). Хотя наши данные неубедительны в вопросе биологической значимости этих различий, наши результаты подтверждают модель, в которой активация опосредуется мотивом BH3, взаимодействующим с канонической BH3-связывающей бороздкой Bax. Наши исследования не имеют прямого отношения к активации Bax с помощью BimBH3 в месте, удаленном от канавки, предложенной другими. 34 , 35

Внутренние полости

Экспериментальные данные указывают на то, что внутренние полости в белках дестабилизируют. 36 Структура BimBH3mini: BaxΔC26 содержит полость, аналогичную расположению и форме, которая наблюдается в опубликованных структурах с пептидами Bid и Bax (коды PDB 4BD2, 4BD6). Хотя объем меньше по сравнению с аналогичной полостью в структуре BidBH3: BaxΔC21, остатки, окружающие полости, являются сходными. В комплексе BimBH3 это F30, L63, I66, G67, V110, V111, F114, Y115, W158 и L161. Из них только I66 непосредственно связывается со связанным пептидом BimBH3, но для связывания пептида действительно требуется большое перемещение спирали 3 и С-концевого конца спирали 2 из их положения в структуре апо BaxΔC21. 7 F30 относится к тем остаткам, у которых амидный резонанс основной цепи сильно зависит от титрования пептида BaxBH3 в BaxΔC21. 37 Мы интерпретируем наличие полостей в ядре Bax при связывании с пептидом-активатором BH3 как признак нестабильности комплекса, предупреждая высвобождение домена-защелки Bax ( α 6– α 8), как требуется для основных доменов. ( α 2– α 5) до димеризации. 7 Обратите внимание, что мы вычислили полость, используя структуру комплекса BimBH3mini: BaxΔC26, потому что аномальная конформация F30 в BimBH3: BaxΔC26, описанная выше, скрывает эффект. Потеря полости в комплексе BimBH3mini: BaxΔC28 при движении α 2 демонстрирует, что положения α 2 и α 8 связаны, но проливает немного дополнительного света на пути разворачивания блокировки. На основании молекулярного моделирования было высказано предположение, что когда Bim связывается с Bax, он вытесняет спираль 8 вследствие столкновения между C-концевыми областями BimBH3 и T167 на Bax. 31 Здесь такого смещения не наблюдалось, хотя пептид, который мы использовали, может быть недостаточно длинным для строгой проверки этого предложения. Удаление спирали 8 на некоторой стадии во время активации Bax, несомненно, является требованием нашей гипотезы, что основной домен должен быть разблокирован, чтобы сделать возможной олигомеризацию. 7

Сравнение с BimBH3, связанным с Bcl-xLΔC

Структурные наложения BidBH3: BaxΔC21 и BaxBH3: BaxΔC21 с просурвивающими белками, связанными с пептидами BH3, позволяют предположить, что пептид был слегка смещен к своему С-концу в комплексе BaxΔC21 по сравнению с просурвивающими белковыми комплексами. 7 Это смещение сопровождалось наблюдением, что спирали Bax α 2 и α 3 были более отдаленными от связанных пептидов BH3 по сравнению с его аналогом Bcl-xL. Подобная особенность теперь очевидна при сравнении пептидов BimBH3, связанных с Bcl-xLΔC и BaxΔC. Эти аномалии, которые могут происходить частично из делеции двух остатков, соединяющих спирали 2 и 3 в Bax по сравнению с Bcl-xL, 7 предлагают частичное объяснение более слабого связывания Bim с Bax по сравнению с просурвивающими белками.

Материалы и методы

Реагенты, пептиды и рекомбинантные белки

Липиды были приобретены у Avanti Polar Lipids, Inc. (Алабастер, Алабама, США). Моющие средства были приобретены у Affymetrix (Санта-Клара, Калифорния, США). Пептиды были приобретены у Mimotopes (Ноттинг-Хилл, Висконсин, Австралия) (BimBH3, BimBH3mini, BimBH3 E145A, BimBH3 P144A / E145A, BimBH3 R153A, BidBH3, BidBH3mini, BidBH3 Aid B3, США, N1, США) , BimBH3 E145K). Три различных конструкции Bax, каждая из которых содержит мутации C62S и C126S и индивидуально укорочены на С-конце 21, 26 и 28 аминокислотами, были экспрессированы и очищены в соответствии с описанным протоколом. 6 Они соответственно обозначаются как BaxΔC21, BaxΔC26 и BaxΔC28. Все три конструкции были клонированы в pTYB1; из-за артефакта клонирования BaxΔC26 и BaxΔC28 содержат два дополнительных остатка (Ser-Ser) на своих C-концах после расщепления инеинов. Белки экспрессировали в клетках Escherichia coli BL21 (DE3) или ER2566, лизировали в TBS (20 мМ Трис (pH8), 150 мМ NaCl) и очищали в две стадии: аффинную хроматографию с хитином с последующей SEC (Superdex75) в TBS.

Подготовка димера ядра / защелки

Димеры core / latch, индуцированные несколькими мутантами пептидов BH3, получали в соответствии с протоколом, аналогичным описанному ранее. 7 BaxΔC21 (2 мг / мл) смешивали с двукратным молярным избытком пептидов BH3 в TBS в присутствии 1% CHAPS. Смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и анализировали с помощью SEC (колонка Superdex75 в TBS), чтобы оценить активность пептида BH3 в отношении димеризации BaxΔC21.

Переплет

Анализы связывания Bax проводили с использованием протокола, модифицированного по сравнению с описанным ранее. 18 BaxΔC21 при 25 нМ инкубировали с увеличивающимися концентрациями пептидов BH3 в SPR-буфере (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3,4 мМ EDTA, 0,005% Tween-20, pH 7,4), содержащем 0,5% октилглюкозида. Образцы вводили в чип CM5, содержащий иммобилизованные BimBH3 и инертные пептиды Bim4E. Специфические ответы связывания BimBH3 оценивали путем вычитания ответов канала Bim4E из ответов канала BimBH3. Значения IC50 рассчитывали с помощью GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Липосомы

Анализы высвобождения липосом проводили с использованием модифицированной версии, описанной ранее. 11 Липосомы, состоящие из 46% фосфатидилхолина, 25% фосфатидилэтаноламина, 11% фосфатидилинозитол, 10% фосфатидилсерины и 8% кардиолипины инкапсулирования самогасящиеся 5 (6) карбокси-флуоресцеин получал путем сушки смесь липидов в хлороформе и 0,01% бутилированного гидрокситолуола в атмосфере N2 и затем ресуспендирование в буфере SUV (10 мМ HEPES (pH 7,5), 135 мМ KCl, 1 мМ MgCl2), содержащем 50 мМ 5 (6) -карбоксифлуоресцеина. Суспензию экструдируют через мембрану с размером пор 100 нм и затем пропускают через колонку PD10 для удаления неинкорпорированного красителя. Липосомы в концентрации 4 мкг / мл инкубировали с 50 нМ полноразмерного Bax и 500 нМ пептида BH3 в буфере SUV в течение 1 часа при комнатной температуре. Флуоресценцию высвобожденного самозатухающего 5 (6) -карбоксифлуоресцеина измеряли при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 535 нм. Полноразмерный Bax для этих экспериментов экспрессировали и очищали, как описано выше.

Цитохром с релизом

BaxS184L стабильно экспрессировался в Bax - / - Bak - / - MEFs, и анализы высвобождения цитохрома с выполняли, как описано для Bak. 23 Фракции супернатанта и осадка отделяли и анализировали на цитохром с с помощью иммуноблоттинга.

Кристаллизация, сбор и обработка данных

Димеры ядра / защелки BaxΔC21, BaxΔC26 или BaxΔC28 индуцировали пептидом BimBH3 или BidBH3, как описано ранее, и очищали с помощью SEC. 7 Очищенный димер концентрировали (5 мг / мл) и добавляли трехкратный молярный избыток пептида за 30 минут до установки лотка для кристаллизации. Пептиды BidBH3, BimBH3mini или BidBH3mini в комплексе с димером ядра / защелки кристаллов BaxI66AΔC21, BaxΔC26 или BaxΔC28 росли в условиях, аналогичных 1 М тринатрийцитрату и 0,1 М какодилату натрия (pH 6,5) при 277 К. Кристаллы были заморожены в жидкость азот с использованием скважинного раствора, дополненного 20% этиленгликолем. Условия кристаллизации для BimBH3: BaxΔC26 были 0,1 М бицином натрия (рН 9,0), 20% PEG6000 при 277 К, и кристаллы замораживали в скважинном растворе, дополненном 20% этиленгликолем. Данные были собраны на линии луча MX2 на австралийском синхротроне (Clayton, VIC, Australia) при 100 K и обработаны с использованием XDS.

кристаллография

Все структуры были решены путем молекулярной замены в Фениксе 39 используя димер ядра / защелки BidBH3: BaxΔC21 в качестве модели (код PDB 4BD2). Окончательные модели для всех структур были достигнуты через несколько циклов строительства в Кут 40 и изысканность в Фениксе. Изображения структуры были созданы с использованием PyMOL (Молекулярная графическая система PyMOL, версия 1.5.0.4; Schrödinger, LLC). Структурные выравнивания были выполнены в PyMOL. Полости были обнаружены с помощью сервера CASTp 32 используя размер зонда по умолчанию (1,4 Å). Координаты и структурные факторы были помещены в банк данных о белках с кодами доступа: 4ZIE (BimBH3: BaxΔC26), 4ZIF (BimBH3mini: BaxΔC26), 4ZIG (BidBH3mini: BaxΔC26), 4ZIH (BimBH3mini: BaxZ3AB B3ΔC BI) B6ΔCB) , показывает кристаллографические данные сбора и уточнения статистики.

Таблица 1

Статистика сбора и уточнения данных

BimBH3: BaxΔC26 BimBH3mini: BaxΔC26 BidBH3mini: BaxΔC26 BimBH3mini: BaxΔC28 BidBH3: BaxI66AΔC21 Длина волны (Å) 0,9537 0,9537 0,9537 0,99537 0,953687 Диапазон Разрешение (Å) 33.97-1.797 (1.861-1.797) 19.77-2.401 (2.486-2.401) 19.96-2.2 (2,278 –2.2) 19.68–2.5 (2.589–2.5) 46.42–2.191 (2.269–2.191) Пространственная группа P 43 21 2 P 43 21 2 P 43 21 2 P 43 21 2 P 43 21 2 Размеры элементарной ячейки (Å) 95.44 95.44 36.35 96.14 96.14 37.26 100.12 100.12 37.41 95.73 95.73 37.1 103.801 103.801 38.01 Всего отражений 228 519 (22 368) 55 437 (5686) 78 642 (7899) 48 467 (4765) 151 151 (12 901) Уникальные отражения 16194 (1580) 7219 (706 ) 10108 (986) 6334 (609) 11053 (1031) Кратность 14,1 (14,2) 7,7 (8,1) 7,8 (8,0) 7,7 (7,8) 13,7 (12,5) Полнота (%) 99,92 (99,43) 99,92 (100,00) 99,96 (100,00) 99,98 (99,84) 98,87 (94,33) Среднее значение I / сигма (I) 30,73 (2,57) 22,48 (2,61) 15,18 (2,61) 18,46 (2,09) 17,29 (1,63) W-фактор Вильсона 26,94 55,14 36,34 52,89 45,35 R-слияние 0,0639 (1,184) ) 0,05781 (0,7918) 0,098 15 (0,8454) 0,08496 (1,018) 0,1086 (1,947) CC1 / 2 1 (0,788) 0,999 (0,783) 0,999 (0,777) 0,999 (0,742) 0,999 (0,684) R-работа 0,1816 (0,2412) 0,2129 (0,3023) 0,2043 (0,2558) 0,2036 (0,2979) 0,1751 (0,3886) без R 0,2288 (0,2727) 0,2685 (0,3728) 0,2372 (0,3016) 0,2581 (0,4060) 0,2230 (0,4209) Количество неводородных атомов 1419 1205 1361 1204 1445 макромолекул 1324 1205 1337 1204 1372 лигандов 4 0 0 0 20 Вода 91 0 24 0 53 Остатки белка 169 162 174 161 176 RMS (связи) 0,006 0,009 0,005 0,009 0,007 RMS (углы) 0,87 1,20 0,66 1,25 1,05 Ramachandran благоприятствует (%) 100 95 98 95 98 Ramachandran выбросов (%) 0 1,3 0 1,9 0,59 Средний B -фактор 38,30 63,30 42,20 57,00 59,90 Макромолекулы 37,70 63,30 42,30 57,00 59,70 Лиганды 44,50 НС NA НК 85,70 Растворитель 46,30 НК 36,10 НД 54,70

Похожие

HWA: Гипоферритинемия без анемии скрытое гематологическое расстройство
... ическое отделение, больница Амири, Кувейт, Кувейт 1 гематологическое отделение, больница Амири, Кувейт, Кувейт Адрес для переписки: д-р Хасан А. Аль-Джафар, отделение гематологии, больница Амири, Кувейт, Кувейт. Эл. адрес: [email protected] Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0, которая позволяет
Веганский пад тай
Тайский пад долгое время был одним из моих любимых блюд. Бывает и так, что это, пожалуй, одно из самых популярных тайских блюд за пределами Таиланда, поэтому я подумал, что настало время его появления в блоге. Для меня и вашего счастья, это не блюдо, которое трудно веганское. В дополнение к пасте я использовал только овощи, но жареное тофу также было бы отличным
MonarchBase: база данных генома бабочки-монарха
... cleic Acids Res. 2013 янв; 41 (проблема с базой данных): D758 – D763. Кафедра нейробиологии, Медицинский факультет Массачусетского университета, 364 Plantation Street, Worcester, MA 01605, США Получено 2012 г. 29 июля; Пересмотрено 2012 Октябрь 9; Принят 2012 окт 11. Это статья открытого доступа, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/
Компьютерные методы в технике. Наш университет организует конференцию
... с. Т. Малона, SAF PL Более 80 ученых, в том числе из Мексики и Украины, а также представители промышленности, он участвует во II Международной научной конференции «Компьютерные методы в технике», которая началась 24 ноября 2017 года в Центре инноваций и передовых технологий Люблинского технологического университета. Его организаторами являются сотрудники, студенты и аспиранты университета. Участники рассказывают о развитии технических наук, численных и экспериментальных
Раскрыто: таблица чистых расходов Премьер-лиги вызывает дебаты по поводу управленческих достижений In...
Раскрыто: таблица чистых расходов Премьер-лиги вызывает дебаты по поводу управленческих достижений Independent.ie Пеп Гвардиолу хвалят как менеджера Премьер-лиги сезона после того, как он привел Манчестер Сити к доминирующему успеху в
... и в предыдущие годы, в октябре начинаются приготовления к многодневной школьной поездке на Польское мо...
... и в предыдущие годы, в октябре начинаются приготовления к многодневной школьной поездке на Польское море"> Как и в предыдущие годы, в октябре начинаются приготовления к многодневной школьной поездке на Польское море. Эта поездка организована для учащихся второго этапа обучения, то есть IV-VI классов. Целью многодневного путешествия является знакомство с Польшей, различными элементами живой и неживой природы, культуры и традиций другого региона, расширение знаний об истории Польши, а также
Приложение Live Racing Racing, результаты и ставки: Racing TV
Возьмите Racing TV с собой, куда бы вы ни пошли, с нашим ассортиментом приложений, которые будут предоставлять вам все последние новости о скачках, результаты, прямые трансляции и функции ставок одним нажатием кнопки. Скачать приложение сегодня для непревзойденного доступа и покрытия. Android
Мониторинг угроз в городе - ГИС в муниципальной гвардии столицы Варшавы Варшава
... c="/wp-content/uploads/2019/12/ru-monitoring-ugroz-v-gorode-gis-v-municipalnoj-gvardii-stolicy-varsavy-varsava-1.png" alt="Муниципальная гвардия столицы Варшава постоянно служит столичной общине, стремясь обеспечить мир и общественный порядок как важный элемент развития города »"> Муниципальная гвардия столицы Варшава постоянно служит столичной общине, стремясь обеспечить мир и общественный порядок как важный элемент развития города ». Деятельность, предпринимаемая в этой области, касается
Тестирование в колледже США
... студенты постоянно достигают высоких академических результатов, обеспечивая поступление во многие похвальные университеты и высшие учебные заведения как в Австралии (Группа 8), так и за рубежом. В настоящее время все большее число студентов TSS посещают университеты и колледжи по всему миру, в частности в Соединенных Штатах и ​​Великобритании. Мы призываем наших студентов искать возможности далеко и поддерживать их поиски, поскольку они преследуют престижные учреждения.
Новый год, новый я? Изображение против данных блога Sotrender
Новый год - это время резолюций и усилий по их осуществлению. Любой, кто регулярно занимается в тренажерном зале (и стоит в очереди за инструментами в январе), знает, что одно из самых популярных новогодних решений - это только начало работы над стройной фигурой. Однако не только многолюдные спортивные залы указывают на популярность физических упражнений, поскольку онлайн-данные показывают, что наш интерес к физической активности, диетам и здоровому питанию усиливается в конце декабря и достигает
One Stop A лучший друг студентов для финансирования будущего
... ит в состав большой команды специалистов One Stop, которые помогают студентам Brandman найти варианты финансирования их обучения. У Университета Брэндмена нет улыбающегося талисмана, чтобы приветствовать новых студентов. У этого есть кое-что намного лучше: специалисты One Stop. Одна остановка Специалисты помогают взрослым студентам найти ответы на их главные вопросы: сколько будет стоить это образование

Комментарии

Итак, какие результаты остаются?
Итак, какие результаты остаются? 4, 5, 6, 8, 9 или 10. Если стрелок бросает любой из них, этот номер становится «точкой», и дилер помечает этот номер на столе шайбой. На следующем броске стрелка, если он или она бросает «точку», это «пас», и линия PASS делает ставку на победу. Ставки «НЕ ПРОЙДИТЕ» проигрывают, и игра окончена. Если стрелок бросает 7 перед броском «очка», ставки «НЕ ПРОЙДИТЕ» выигрывают. Игрокам НЕ ПРОЙТИ разрешено снимать свои ставки в любое время. Все выигрыши платят даже
Может быть, вы только начинаете говорить с ней на важные темы и прислушиваться к ее советам?
Может быть, вы только начинаете говорить с ней на важные темы и прислушиваться к ее советам? Возможно, вы этого не знаете, но моя мама скучает по вам, даже если она этого не показывает . Каждый ваш контакт с ней теперь на вес золота. Она часто упоминает моменты, когда вы жили вместе, и могла говорить с вами каждый день. Мама хотела бы знать, что ей иногда не хватает ее тоже. Ключ выбора подарка: контакт Выбирая рождественский подарок

Новый год, новый я?
Итак, какие результаты остаются?
Может быть, вы только начинаете говорить с ней на важные темы и прислушиваться к ее советам?
Мяч TORRES BM600
Мяч TORRES BM600
Цена:   580,00 руб.
Бревно гимнастическое высокое переменной высоты, 5 м
Бревно гимнастическое высокое переменной высоты, 5 м
Цена:   26.621,00 руб.
Козел гимнастический
Козел гимнастический
Цена:   5.762,00 руб.

+ Pасширенный поиск
Каталог товаров
  • Спорт
  • Баскетбол
  • Велоспорт
  • Тренировка
  • Спортсмен
  • Волейбол
  • Гимнастика
  • Мышцы
  • Футбол
  • Новости



  • О компании Условия доставки Прямая линия Вакансии Контакты