Melanoma Antigen-A11 (MAGE-A11) усиливает транскрипционную активность, связывая димеры андрогеновых рецепторов

1. MAGE-A11 увеличивается во время прогрессирования рака простаты Предыдущие исследования показали увеличение...
2. MAGE-A11 увеличивает рост клеток рака простаты
3. AR без ДНК-связывающего домена сохраняет транскрипционную активность в присутствии MAGE-A11 и AR дикого типа
4. AR синергизм в клетках LAPC-4
5. MAGE-A11 опосредует синергизм между эндогенным AR и теоретическим вариантом AR сплайсинга
6. MAGE-A11 спасает дополнительные неактивные мутанты AR
7. MAGE-A11 Ссылки AR Димеры

MAGE-A11 увеличивается во время прогрессирования рака простаты

Предыдущие исследования показали увеличение мРНК MAGE-A11 в ксенотрансплантате CWR22 после кастрации и в клинических образцах кастрационно-рецидивного рака предстательной железы, предполагая, что MAGE-A11 способствует прогрессированию рака простаты ( 8 ). Интенсивность иммуноокрашивания MAGE-A11 была относительно слабой в железистых эпителиальных клетках 17 образцов андроген-стимулированной доброкачественной простаты, как показано для четырех репрезентативных образцов (, A – D ). Окрашивание MAGE-A11 усиливалось в железистых эпителиальных клетках у ~ 70% (11 из 16) образцов андроген-стимулированного рака предстательной железы (, E – H ) и было более равномерным и интенсивным у 82% (девять из 11) кастрационно-рецидивирующей простаты образцы рака (, I – L ).

MAGE-A11 иммуноокрашивание при доброкачественном раке предстательной железы и простате. MAGE-A11 иммуноокрашивали с использованием 3 мкг / мл антитела MAGE- (94–108), как описано в разделе «Экспериментальные процедуры». Четыре показанных образца представляют 17 образцов андроген-стимулированной доброкачественной простаты ( A – D ), 16 образцов андроген-стимулированный рак простаты ( E – H ) и 11 образцов кастрационно-рецидивного рака предстательной железы ( I – L ). Коричневый положительный продукт реакции показан на фоне окрашивания гематоксилином. Начальное увеличение , 400 ×.

Увеличение иммуноокрашивания MAGE-A11 в большинстве образцов андрогензависимого и кастрационно-рецидивного рака предстательной железы согласуется с функцией MAGE-A11 в качестве AR-корегулятора. Повышенные уровни MAGE-A11, вероятно, способствуют большей трансактивации AR и росту и прогрессированию рака простаты.

Циклический AMP увеличивает активность MAGE-A11 и AR

цАМФ усиливает транскрипционную активность AR в клетках рака предстательной железы благодаря механизмам, которые не совсем понятны ( 34 , 35 ). Были проведены исследования, чтобы выяснить, регулируется ли MAGE-A11 и опосредует ли действие сигнальных молекул, происходящих из клеток рака предстательной железы, таких как цАМФ, которые усиливают андроген-зависимую и андроген-независимую трансактивацию AR. В дополнение к эффектам на уровни эндогенных мРНК MAGE-A11 и PSA, два андроген-чувствительных репортерных гена были использованы для оценки транскрипционной активности AR в ответ на цАМФ и / или DHT. MMTV-Luc содержит длинную концевую область повтора промотора MMTV со сложными ДНК-связывающими элементами для AR и других стероидных рецепторов ( 36 - 39 ). PSA-Enh-Luc содержит комплексный восходящий энхансер гена PSA человека с множеством сайтов связывания ARE, которые функционируют совместно ( 25 ). MMTV-Luc более чувствителен, чем PSA-Enh-Luc к эндогенному AR ( 1 , 40 ) и был использован в основном для изучения трансактивации AR в клетках рака предстательной железы LAPC-4. PSA-Enh-Luc использовали в клетках LAPC-4, которые экспрессируют эндогенный AR, и в клетках CV1, в которых отсутствует AR.

Клетки LAPC-4, культивируемые в свежей среде ежедневно, показали 30–40-кратное увеличение андроген-зависимой трансактивации MMTV-Luc экспрессированным и эндогенным AR ( A , слева ). Клетки, выдерживаемые в течение 48 ч без изменения среды, показали 8-кратное увеличение лиганд-независимой трансактивации экспрессируемым AR ( A , в середине ). Клетки LAPC-4, культивируемые в течение 72 ч без изменения среды, демонстрировали 18-кратное увеличение лиганд-независимой трансактивации экспрессируемой AR и 3-6-кратное увеличение лиганд-независимой активности эндогенной AR ( A , справа ). Условия культивирования клеток оказывали меньшее влияние в присутствии 1 нМ DHT. Результаты показывают, что сигнальные молекулы, полученные из клеток LAPC-4, усиливают лиганд-независимую трансактивацию AR.

Циклическое AMP-зависимое увеличение MAGE-A11 коррелирует с повышенной трансактивацией AR PSA в клетках LAPC-4. Пустой вектор pCMV5 (-) или pCMV-AR (0,1 мкг) экспрессировали в клетках LAPC-4 (2 × 105 / лунку) в 12-луночных планшетах с 0,2 мкг MMTV-Luc / лунку. На следующий день среду заменяли или не меняли, а через 24 часа ее заменяли бессывороточной средой или не меняли. Затем клетки инкубировали в течение 24 ч с или без 1 нМ DHT и измеряли активность люциферазы. B , клетки LAPC-4 (4 × 105 / лунку) в 6-луночных планшетах трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 с 0,25 мкг MMTV-Luc. На следующий день клетки помещали в бессывороточную среду с или без 0,2, 0,5, 1, 3 или 6 мМ дибутирил-цАМФ ( dbcAMP ) с или без 1 нМ DHT, и измеряли активность люциферазы. С , на следующий день после посева клеток LAPC-4 (чашка размером 2 × 106/6 см) клетки переносили в среду, содержащую 10% очищенную от угля сыворотку, и на следующий день клетки обрабатывали 0,5 или 2 или без них. 8 мм дибутирил-цАМФ в течение 48 часов. РНК экстрагировали и анализировали с использованием количественной ОТ-ПЦР для MAGE-A11, как описано в разделе «Экспериментальные процедуры». D , на следующий день после посева клеток LAPC-4, как и в C , клетки переносили в среду, содержащую 5% очищенную от угля сыворотку, и обрабатывали с 0,5, 2 или 8 мМ дибутирил-цАМФ или без него в течение 48 часов. Клетки собирали в буфере для лизиса иммуноблота, и 40 мкг белка / дорожки исследовали с использованием антитела FLAG-MAGE (10 мкг / мл). Дорожка 1 содержит 0,1 мкг контрольного экстракта клеток COS1 ( C ) из клеток, экспрессирующих pSG5-MAGE. E , комплементарную ДНК, использованную в C, анализировали с использованием количественной ОТ-ПЦР для PSA, как описано в разделе «Экспериментальные процедуры». PPIA , пептидилпролил-изомераза A. Данные в A-C и E представляют собой среднее значение ± SD ( столбцы ошибок ) и представляют три независимых эксперимента.

Разнообразные агенты были протестированы в попытке имитировать эффекты кондиционированной среды на лиганд-независимую транскрипционную активность AR в клетках LAPC-4. Небольшое увеличение андроген-зависимой и андроген-независимой активности АР наблюдалось при 50 нг / мл EGF, 50 нг / мл IL-6 или 10 нг / мл инсулиноподобного фактора роста I, и большее увеличение наблюдалось в ответ на 6 мМ дибутирил-цАМФ по эндогенному и экспрессированному АР (данные не показаны). Эндогенную AR-активность анализировали в клетках LAPC-4 с повышением концентрации дибутирил-цАМФ, чтобы определить, можно ли объяснить воздействие кондиционированной среды на лиганд-независимую AR-транскрипционную активность с помощью передачи сигналов цАМФ. В ответ на 0,2–6 мМ дибутирил-цАМФ с или без 1 нМ DHT ( B ) наблюдалось зависимое от концентрации увеличение трансактивации эндогенного АР. Увеличение концентрации дибутирил-цАМФ от 0,5 до 8 мМ увеличивало мРНК MAGE-A11 в клетках LAPC-4, измеренную с помощью количественной ОТ-ПЦР ( C ), и увеличивало белок MAGE-A11, показанный с помощью иммуноблот-анализа ( D ). Увеличение мРНК и белка MAGE-A11 в ответ на 0,5 мМ дибутирил-цАМФ коррелировало с увеличением количества эндогенной мРНК PSA ( E ), которое снижалось при более высоких уровнях дибутирил-цАМФ, что свидетельствует о негативной регуляции обратной связи.

Прямая связь между передачей сигналов цАМФ, повышенной экспрессией MAGE-A11 и повышенной транскрипционной активностью AR была показана с помощью siRNA. MAGE-A11 siRNA-2, который наиболее эффективно снижал уровни экспрессированного MAGE-A11 ( A , нижняя панель ), уменьшал андроген-зависимую и андроген-независимую транскрипционную активность эндогенной AR в клетках LAPC-4 в ответ на 0,2 мМ дибутирил-цАМФ ( А , верхняя панель ). МиРНК-3 MAGE-A11 и неспецифическая миРНК были менее эффективны в снижении экспрессии MAGE-A11 и транскрипционной активности эндогенной AR в клетках LAPC-4. Неспособность siRNA-3 полностью подавлять экспрессию MAGE-A11 и ее влияние на транскрипционную активность AR согласуется с предыдущими исследованиями ( 6 ). Стимулирующее действие EGF на эндогенную активность AR в клетках LAPC-4 также ингибировалось сайленсингом миРНК MAGE-A11 ( B ). Это согласуется с EGF-регуляцией фосфорилирования MAGE-A11, необходимого для активности корегулятора стероидных рецепторов ( 14 ).

Потребность в MAGE-A11 в циклической AMP-зависимой транскрипционной активности AR и росте клеток рака простаты LAPC-4. A , top , клетки LAPC-4 (3 × 105 / лунку) в 6-луночных планшетах трансфицировали 0,25 мкг MMTV-Luc и 5 нМ неспецифического ( NS ) или миРНК-2 или миРНК-3 MAGE-A11 с использованием Липофектамина 2000 На следующий день клетки инкубировали в течение 24 ч с или без 1 нМ DHT и 0,2 мМ дибутирил-цАМФ ( dbcAMP ) перед анализом на люциферазу. Внизу пустой вектор pSG5 (-) ( дорожка 1 ) или pSG5-MAGE (1 мкг; дорожки 2–5 ) экспрессировали в клетках COS1 с использованием липофектамина 2000 с или без концентрации 5 нМ двух неспецифических миРНК ( NS ), MAGE- МиРНК-2 ( M2 ) A11 или миРНК-3 MAGE-A11 ( M3 ). Клеточные экстракты (10 мкг белка / полоса) исследовали на трансблоте с использованием 10 мкг / мл антитела MAGE- (94–108), инкубированного в течение 72 ч при 4 ° С. В , клетки LAPC-4 трансфицировали 0,5 мкг MMTV-Luc и 5 нМ неспецифической миРНК ( NS ), миРНК-2 MAGE-A11 или миРНК-3 MAGE-A11. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT и 10 нг / мл EGF перед анализом на люциферазу. C , клетки LAPC-4 (3 × 106 / лунку) в 6-луночных планшетах трансдуцировали 150 мкл лентивируса для MAGE-A11, shRNA-169 ( M169 ), shRNA-827 ( M827 ), shRNA-947 ( M947 ), и shRNA-964 ( M964 ), AR shRNA-5, пустой вектор или 18-bp неспецифическая ( NS ) shРНК. Клетки отбирали с использованием пуромицина, как описано в разделе «Экспериментальные процедуры». Клеточные экстракты (100 мкг белка / полоса) анализировали на иммуноблотах с использованием антител AR32 (1 мкг / мл) и AR52 (10 мкг / мл), 10 мкг / мл. Антитело FLAG-MAGE, антитело MAGE- (94–108) 5 мкг / мл и разведение β-актинового антитела 1: 5000. Дорожка 8 содержит экстракты клеток COS1, экспрессирующих pCMV-AR (5 мкг белка / дорожка) или pSG5-MAGE (0,1 мкг белка / дорожку) в качестве контроля ( C ). D , клетки LAPC-4, трансдуцированные лентивирусом и отобранные как в С с использованием пуромицина, выращивали в присутствии 0,1 нМ DHT и 10 нг / мл EGF в 24-луночных планшетах. Также показан контроль негормональных клеток LAPC-4, трансдуцированных неспецифической лентивирусной шРНК и выращенных в отсутствие DHT и EGF (-). Рост клеток анализировали, как описано в разделе «Экспериментальные процедуры». NV , вируса нет. Данные в A , B и D представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( столбцы ошибок ), по меньшей мере, для трех независимых экспериментов.

Результаты показывают, что увеличение MAGE-A11 при кастрационно-рецидивирующем раке предстательной железы регулируется передачей сигналов cAMP. Потребность в MAGE-A11 в цАМФ-зависимом увеличении транскрипционной активности AR предполагает, что MAGE-A11 опосредует эффекты цАМФ.

MAGE-A11 увеличивает рост клеток рака простаты

Потребность в MAGE-A11 в росте клеток LAPC-4 в ответ на DHT была продемонстрирована с использованием лентивирусной shRNA. Лентивирус MAGE-A11 shRNA-947 и shRNA-169 ингибировал эндогенную экспрессию MAGE-A11 в клетках LAPC-4 на основе анализа иммуноблота ( C ) и ингибировал рост клеток LAPC-4 ( D ). Неспецифические shРНК и MAGE-A11 shRNA-827 оказали незначительное влияние на уровни белка MAGE-A11 ( C ) или на рост клеток LAPC-4 ( D ). Тем не менее, рост клеток LAPC-4 ингибировался нокдауном AR по лентивирусу ( C и D ). Результаты показывают, что MAGE-A11 необходим для андроген-зависимого AR-опосредованного роста клеток LAPC-4.

AR без ДНК-связывающего домена сохраняет транскрипционную активность в присутствии MAGE-A11 и AR дикого типа

Ранее мы показали, используя иммунопреципитацию хроматина, что MAGE-A11 был рекрутирован на эндогенный чувствительный к андрогену энхансер PSA в клетках LAPC-4 ( 6 ). Однако механизмы, с помощью которых MAGE-A11 увеличивает транскрипционную активность AR у андроген-чувствительного энхансера, остаются неопределенными. Чтобы идентифицировать механизмы, с помощью которых MAGE-A11 повышает транскрипционную активность AR в клетках рака предстательной железы, анализировали серию мутантов AR с одной аминокислотой и делецией ( A ) в клетках LAPC-4, которые экспрессируют эндогенный AR дикого типа и MAGE-A11 ( 8 ). Низкий уровень чувствительного к андрогенам MMTV-Luc был использован для минимизации активации эндогенным AR.

Требования AR для транскрипционной активности в клетках LAPC-4. А - схематическая диаграмма делеционных мутантов AR, экспрессируемых в клетках LAPC-4. LBD , лиганд-связывающий домен. B , top , pCMV5 (-) или pCMV-AR дикого типа (WT) или мутанты (0,1 мкг) экспрессировали в клетках LAPC-4 с 25 нг MMTV-Luc. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Внизу pCMV5 (-) или pCMV-AR WT или мутанты (5 мкг) были экспрессированы в клетках COS1. Трансблот клеточных экстрактов (15 мкг белка / полоса) исследовали с использованием антитела AR32. C , top , pCMV5 (-) или pCMV-AR WT или мутанты (0,1 мкг) экспрессировали в клетках LAPC-4 с 25 нг MMTV-Luc. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Внизу pCMV5 (-) или pCMV-AR WT или мутанты (5 мкг) были экспрессированы в клетках COS1, как и в B. Трансблот клеточных экстрактов (15 мкг белка / полоса) исследовали с использованием антитела AR32. D , top , pCMV5 (-) или pCMV-AR WT или делеционные мутанты AR (0,1 мкг) экспрессировали в клетках LAPC-4 с 25 нг MMTV-Luc. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Внизу делеционные мутанты pCMV5 (-) или pCMV-AR WT или AR (6 мкг) были экспрессированы в клетках COS1. Трансблот клеточных экстрактов (20 мкг белка / полоса) исследовали с использованием антитела AR32. E , pCMV5 (-), pCMV-AR WT или pCMV-ARΔDBD (0,1 мкг) экспрессировали в клетках LAPC-4 с 0,1 мкг PSA-Enh-Luc, PSA-Enh-SIII-Luc или pGL3-E4- Люк. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. В B – E показаны средние значения ± стандартное отклонение ( столбцы ошибок ), представляющие три независимых эксперимента.

AR-D864G - это естественная мутация в лиганд-связывающем домене, которая снижает связывание андрогенов и вызывает полную нечувствительность к андрогенам ( 16 ). Мутации AR-R617M, K618M, -K632M, K633M (ARm4) прерывают двунаправленный ядерный нацеливающий сигнал, вызывая цитоплазматическую локализацию AR ( 17 ). Оба этих мутанта AR были неактивны при экспрессии в клетках LAPC-4 ( B ).

Мутация AR-K720A AF2 в лиганд-связывающем домене блокирует связывание мотива р160 коактиватора L XX LL, но не мешает андроген-зависимому взаимодействию AR N / C ( 18 ). Мутация AR-V716R AF2 блокирует рекрутирование коактиватора p160 и взаимодействие AR N / C. Эти мутанты AR AF2 сохраняли полную (AR-K720A) или частичную активность (AR-V716R), что указывает на роль андрогензависимого взаимодействия AR N / C для активности AR, экспрессируемой в клетках LAPC-4. На потребность в взаимодействии AR N / C также указывает сниженная активность мутантов AR F XX LF-мотива, AR-L26A, F27A (AR-LFAA) и комбинированных мутаций F XX LF и W XX LF-мотива в AR-LFAA. -W433A, L436A, F437A (AR-LFAA-A X ) ( C ) ( 3 , 7 ).

ARΔ538–614 (ARΔDBD) является мутантом делеции ДНК-связывающего домена, а ARΔ589–628 (ARΔC) имеет делецию экзона С в ДНК-связывающем домене ( 20 ). Оба мутанта AR, дефектные по связыванию ДНК, сохраняли транскрипционную активность в клетках LAPC-4 ( B ), сходную с AR-C576A, которая также дефектна в связывании ДНК из-за одной аминокислотной мутации в домене связывания ДНК AR ( 17 ). Напротив, активность AR терялась при делеции AR NH2-концевого AF1 в ARΔ142–337 (ARΔTR) или меньших делеций AF1 ( D ) за исключением ARΔ199-239, которые оказывали стимулирующее действие.

Транскрипционная активность AR-мутантов ДНК-связывающего домена в клетках LAPC-4 позволяет предположить, что взаимодействие с андроген-чувствительной областью ДНК может не требоваться для активности. Чтобы проверить это далее, AR и ARΔDBD дикого типа были экспрессированы в клетках LAPC-4 с андроген-чувствительным PSA-Enh-Luc. AR был более активным, чем ARΔDBD; однако ARΔDBD сохранял значительную андроген-зависимую активность ( E , слева ). Разрушение высокоаффинного ARE-III в энхансере PSA в PSA-Enh-SIII-Luc ( 25 ) приводят к сходной транскрипционной активности AR и ARΔDBD ( E , middle ). Потребность в области андрогенного ответа PSA для трансактивации ARΔDBD была продемонстрирована потерей активности AR и ARΔDBD с делецией энхансера PSA ( E , справа ).

Врожденная неактивность ARΔDBD и AR-C576A ДНК-связывающих мутантов и ARΔTR AF1 делеционного мутанта была подтверждена в клетках CV1, которые не экспрессируют эндогенный AR или MAGE-A11. Ни один из мутантов домена связывания ДНК AR или ARΔTR не был активен в клетках CV1 с ​​или без экспрессии MAGE-A11 и p300 ( A ). Тем не менее, MAGE-A11 и p300, мощная ацетилтрансфераза, которая взаимодействует с MAGE-A11 ( 6 ), повышенная андроген-зависимая и андроген-независимая активность АР дикого типа в отсутствие или в присутствии 1 нМ DHT (, А и В ). Усиливающий транскрипцию эффект MAGE-A11 и p300 в отсутствие андрогена был устойчив к ингибированию гидроксифлутамидом и бикалутамидом, двумя антиандрогенами, используемыми при лечении рака предстательной железы ( C ).

Требования AR для трансактивации в клетках CV1. A , pCMV-AR WT, ΔDBD, C576A или ΔTR (25 нг) экспрессировали в клетках CV1 с ​​0,25 мкг PSA-Enh-Luc с или без 0,1 мкг pSG5 (-) или 50 нг pSG5-MAGE ( M) ) и 50 нг pSG5-HA-p300 ( P ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. B , pCMV-AR (50 нг) экспрессировали в клетках CV1 (3 × 104 / лунку) в 12-луночных планшетах с 0,1 мкг PSA-Enh-Luc и 0,1 мкг pSG5 (-) или 50 нг pSG5-MAGE ( М ) и / или 50 нг pSG5-HA-p300 ( P ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. C , клетки CV1 высевали в среду без фенолового красного, содержащую 5% очищенной от углей фетальной сыворотки теленка, и среда не изменялась. pCMV-AR (25 нг) экспрессировали с помощью 0,25 мкг PSA-Enh-Luc и 0,1 мкг pSG5 (-) или 50 нг pSG5-MAGE ( M ) и 50 нг pSG5-HA-p300 ( P ). За двадцать четыре часа до сбора DHT добавляли до 0,1 или 1 нм с 0,5 мкМ гидроксифлутамида ( HF ) или без него или 1 мкМ бикалутамида ( BIC ) или без него. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( столбцы ошибок ), представляющие три независимых эксперимента

Результаты показывают, что транскрипционная активность AR, экспрессируемого в клетках LAPC-4, зависит от ядерной локализации AR, NH2-концевого AF1, андроген-зависимого взаимодействия N / C и связывания с ДНК ARE. Однако активация транскрипции с помощью экспрессированного AR не требует связывания ДНК в присутствии эндогенного AR дикого типа. AR, экспрессируемый в клетках LAPC-4, по-видимому, взаимодействует с эндогенным AR для активации транскрипции.

AR синергизм в клетках LAPC-4

Чтобы понять основу для активности ARΔDBD в клетках LAPC-4, были проведены исследования с использованием AR siRNA-3, который нацелен на лиганд-связывающий домен, присутствующий в AR и ARΔDBD, и на AR siRNA-4, который нацелен на AR-ДНК-связывающий домен, отсутствующий в ARΔDBD ( А ). Специфичность нокдауна миРНК была показана с помощью иммуноблот-анализа.

Зависимость активности ARΔDBD от эндогенного AR и MAGE-A11 в клетках LAPC-4. А - схематическая диаграмма человеческого AR ( hAR ) с сайтом взаимодействия 23F XX LF XX V XX V33 для MAGE-A11, AF1, DBD, лиганд-связывающего домена ( LBD ) и AF2. Положение-мишень указано для AR siRNA-3 в лиганд-связывающем домене и для AR siRNA-4 в DBD. B , pCMV5 (-) ( дорожки 1 и 6 ), pCMV-AR ( дорожки 2–5 ) или pCMV-ARΔDBD ( дорожки 7–10 ) (0,5 мкг) экспрессировали в клетках COS1 с использованием Lipofectamine 2000 с или без 10 нм. AR миРНК-3, AR миРНК-4 или неспецифическая ( NS ) миРНК. Клетки инкубировали без DHT и клеточные экстракты (15 мкг белка / полоса) исследовали на трансблотах с использованием антитела AR32. C , pCMV5 (-) или pCMV-AR WT или ΔDBD (25 нг) экспрессировали в клетках LAPC-4 (4 × 105 / лунку) в 6-луночных планшетах с использованием липофектамина с 25 нг MMTV-Luc с или без 10 нМ AR siRNA-3 ( AR3 ), AR siRNA-4 ( AR4 ), MAGE-A11 siRNA-2 ( MAG2 ) или неспецифическая ( NS ) миРНК. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Данные представляют собой среднее значение ± SD ( столбцы ошибок ) и представляют три независимых эксперимента.

AR siRNA-3 и siRNA-4 снижали экспрессию AR ( B , дорожки 2–5 ), тогда как только AR siRNA-3 уменьшала ARΔDBD ( B , дорожки 7–10 ). В анализах AR транскрипции AR siRNA-3 и siRNA-4 уменьшали слабую активность эндогенного AR ( C , слева ) и большую активность экспрессированных AR дикого типа и ARΔDBD ( C , справа ). МиРНК-2 MAGE-A11, которая снижала экспрессию MAGE-A11 (см. A ), также снижала AR и ARΔDBD-активность в клетках LAPC-4 ( C ).

Результаты предполагают, что транскрипционная активность ARΔDBD, экспрессируемого в клетках LAPC-4, происходит от сотрудничества с эндогенным AR. Снижение активности ARΔDBD при молчании MAGE-A11 позволяет предположить, что MAGE-A11 способствует совместной активности экспрессированного и эндогенного AR.

MAGE-A11 опосредует синергизм между эндогенным AR и теоретическим вариантом AR сплайсинга

Варианты сплайсинга AR, в которых отсутствует лиганд-связывающий домен, описаны при раке предстательной железы ( 41 , 42 ). Конститутивно активный AR- (1–660) содержит AR NH2-концевой и ДНК-связывающий домены и представляет интерес, поскольку он транскрипционно активен в отсутствие DHT и сходен с описанными вариантами сплайсинга AR. AR- (1–660) с инактивирующей ДНК-мутацией C576A или без нее экспрессировали в клетках LAPC-4, чтобы определить, способствует ли MAGE-A11 синергизму между вариантами сплайсинга AR дикого типа и AR.

AR- (1–660) был активен в отсутствие или в присутствии 1 нМ DHT ( A ), тогда как AR- (1–660) -C576A сохранял активность только в присутствии DHT. Андрогензависимая активность AR- (1–660) -C576A была потеряна с AR- (1–660) -LFAA-C576A, в котором был изменен AR NH2-концевой мотив F XX LF. Это предполагает синергизм в клетках LAPC-4 между эндогенной AR и AR- (1–660), который требует AR- (1–660) NH2-концевой мотив F XX LF.

Кооперативность между эндогенным AR и AR- (1–660) в клетках LAPC-4. A top , pCMV5 (-) или pCMV-AR- (1–660) WT, C576A или L26A, F27A (LFAA) -C576A (0,1 мкг) экспрессировали с 25 нг MMTV-Luc в клетках LAPC-4. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Внизу pCMV5 (-) или pCMV-AR- (1–660) WT, C576A или LFAA-C576A (5 мкг) экспрессировали в клетках COS1. Клеточные экстракты (20 мкг белка / полоса) исследовали на трансблотах с использованием антитела AR32. B , pCMV-AR- (1–660) -C576A (25 нг) экспрессировали в клетках LAPC-4 с использованием Lipofectamine 2000 с 25 нг MMTV-Luc и 5 нМ неспецифической ( NS ) миРНК, AR siRNA-3 ( AR3 ) , AR siRNA-4 ( AR4 ), MAGE-A11 siRNA-2 ( M2 ) или MAGE-A11 siRNA-3 ( M3 ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. C , top , pCMV5 (-) или pCMV-AR- (1–503) WT, LFAA, W433A, L436A, F437A ( AX ) или LFAA-A X (0,1 мкг) экспрессировали в клетках LAPC-4 с 25 нг ММТВ-Люк. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Внизу pCMV5 (-) или pCMV-AR- (1–503) WT, LFAA, A XX AA ( AX ) или комбинированный мутант (5 мкг) были экспрессированы в клетках COS1. Трансблот клеточных экстрактов (10 мкг белка / полоса) исследовали с использованием антитела AR32. D , pCMV5 (-) или pCMV-AR- (1–660) -C576A или -AR- (1–660) -LFAA-C576A (10 нг) экспрессировали с 0,25 мкг PSA-Enh-Luc с или без 25 нг pCMV-ARΔTR или ARΔTR-V716R с 50 нг pSG5 (-) или pSG5-MAGE ( M ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. E , 10 нг pCMV5 (-) или 2 нг pCMV-AR- (1–660) экспрессировали в клетках CV1 с ​​0,25 мкг PSA-Enh-Luc с или без 10 нг pCMV-AR и 50 нг pSG5 (-) или pSG5-MAGE ( M ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Данные в A – E представляют собой среднее значение ± SD ( столбцы ошибок ) и представляют три независимых эксперимента.

Чтобы проверить потребность в эндогенных AR и MAGE-A11 в активности AR- (1–660) -C576A в клетках LAPC-4, проводили ингибирование siRNA. AR siRNA-3 и siRNA-4 нацелены на AR-лиганд и ДНК-связывающие домены соответственно () и устраняют активность AR- (1–660) -C576A ( B ). Это свидетельствует о том, что активность AR- (1–660) -C576A в присутствии DHT является результатом синергизма с эндогенным AR. МиРНК-2 MAGE-A11, которая уменьшает экспрессию MAGE-A11 (), также ингибирует активность AR- (1–660) -C576A, участвуя в MAGE-A11 в синергизме между вариантами сплайсинга AR и AR.

Требование к AR F XX LF мотиву и ДНК-связывающему домену было протестировано одновременно с использованием AR- (1–503), который содержит только AR NH2-концевую область. Несмотря на отсутствие AR-ДНК и лиганд-связывающих доменов, AR- (1–503) увеличивал андроген-зависимую транскрипционную активность в клетках LAPC-4 в присутствии DHT, которая ингибировалась AR- (1–503) F XX LF или W XX LF мотив мутаций (с).

Зависимость от варианта AR сплайсинга AF1 и мотива F XX LF для активности с MAGE-A11 и AR исследовали путем экспрессии AR- (1–660) -C576A с полноразмерным AR с делецией AF1 (ARΔTR) или с AF1 и AF2 инактивирующие мутации (ARΔTR-V716R), которые разрушают оба основных домена активации AR. MAGE-A11 активировал AR- (1–660) -C576A, экспрессируемый с помощью ARΔTR или ARΔTR-V716R, в той же степени ( D ), предполагая, что AR- (1–660) -C576A AF1 выполняет основную функцию трансактивации. Однако эффекты MAGE-A11 были потеряны с AR- (1–660) -LFAA-C576, в котором мотив AR F XX LF был мутирован. Результаты предполагают, что кооперативная функция среди MAGE-A11, AR и варианта сплайсинга AR зависит от варианта сплайсинга AR AF1 и мотива F XX LF.

MAGE-A11 взаимодействует с AR NH2-терминальным мотивом F XX LF ( 4 ), увеличивает AR- (1–660) активность непосредственно ( E , слева ) и увеличивает активность AR дикого типа в отсутствие или в присутствии андрогена ( E , середина ). Однако, когда MAGE-A11 был экспрессирован с низким уровнем AR и конститутивно активным AR- (1–660), наибольшим эффектом по сравнению с одним AR было MAGE-A11-зависимое увеличение активности в отсутствие андрогена ( E , справа ).

Результаты предполагают, что MAGE-A11 необходим для совместной функции AR и вариантов AR сплайсинга при раке предстательной железы ( 10 ). Увеличение транскрипционной активности AR зависит от AR- (1–660) NH2-концевого мотива F XX LF и AF1.

MAGE-A11 спасает дополнительные неактивные мутанты AR

Одним из объяснений синергетического воздействия MAGE-A11 на активность AR является то, что MAGE-A11 обеспечивает взаимодействие между димерами AR. Это было исследовано путем экспрессии комплементарных неактивных мутантов AR в клетках CV1. ARΔTR имеет делецию NH2-концевого AF1 (см. A ) и был неактивен в клетках CV1 в присутствии DHT с или без экспрессии MAGE-A11 и p300 ( A ). ДНК-связывающие мутанты AR-C576A или ARΔDBD также были неактивны в CV1 в присутствии DHT с или без MAGE-A11 и p300. Однако транскрипционная активность ARΔTR, экспрессируемого с помощью AR-C576A или ARΔDBD, была восстановлена ​​с помощью экспрессии MAGE-A11 и p300 в присутствии DHT ( A ).

MAGE-A11 спасает комплементарные неактивные мутанты AR. A , pCMV5 (-), pCMV-ARΔTR, -C576A и / или -ΔDBD (25 нг) были экспрессированы в клетках CV1 с ​​0,25 мкг PSA-Enh-Luc и 0,1 мкг pSG5 (-) или 50 нг pSG5 -MAGE ( M ) и 50 нг pSG5-HA-p300 ( P ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. На вставке pCMV5 (-) или pCMV-AR WT, ΔTR или ΔTR-C576A (8 мкг) экспрессировали в клетках COS1. Клетки инкубировали с 10 нМ DHT. Трансблот клеточных экстрактов (20 мкг белка / полоса) исследовали с использованием антитела AR32. B , pCMV-ARΔTR и -AR-C576A отдельно ( первая черта , 25 нг; вторая черта , 50 нг) или ARΔTR и AR-C576A (25 нг каждая) были экспрессированы в клетках CV1 с ​​0,25 мкг PSA-Enh-Luc с или без 0,1 мкг pSG5 или 50 нг pSG5-MAGE ( M ) и / или 50 нг pSG5-HA-p300 ( P ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. C , pCMV-ARΔTR и -ARΔDBD (25 нг) были экспрессированы в клетках CV1 с ​​0,25 мкг PSA-Enh-Luc и 50 нг pSG5 (-), pSG5-MAGE ( MAG ), pSG5-HA-p300 и / или pSG5-TIF2. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. D , pCMV-ARΔTR и / или -ARΔDBD (25 нг) экспрессировали в клетках CV1 с ​​0,25 мкг PSA-Enh-Luc и 100 нг pSG5 (-) или с 25, 50 или 100 нг pSG5-MAGE. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Данные в A – D представляют собой среднее значение ± SD ( столбцы ошибок ) и представляют три независимых эксперимента.

ARΔTR и AR-C576A экспрессировали вместе с MAGE-A11, p300 или MAGE-A11 и p300, чтобы дифференцировать эффекты MAGE-A11 и p300. Подобное увеличение активности ARΔTR, экспрессируемой только с AR-C576A и MAGE-A11, по сравнению с MAGE-A11 и p300 ( B ), указывает на то, что MAGE-A11 является основным катализатором в спасении андроген-зависимой транскрипции комплементарными неактивными мутантами AR. Способствующая роль коактиватора p160 TIF2 в эффектах MAGE-A11 не была очевидна в этих экспериментах ( C ). Действительно, активность ARΔTR, экспрессируемого с помощью ARΔDBD, была снижена дозозависимым способом путем увеличения количества MAGE-A11 ( D ).

Усиливающие транскрипцию эффекты MAGE-A11 на активность AR зависят от AR NH2-концевого мотива F XX LF, который также опосредует андроген-зависимое взаимодействие AR N / C ( 4 ). Зависимость от мотива AR F XX LF для транскрипционного спасения MAGE-A11 комплементарных неактивных форм AR была показана с мутациями в мотивах F XX LF одного или обоих неактивных мутантов AR. Андрогензависимая транскрипционная активность наблюдалась в присутствии MAGE-A11 и экспрессии ARΔTR с AR-LFAAΔDBD или экспрессии AR-LFAAΔTR с ARΔDBD ( A ). Однако MAGE-A11 не восстанавливал активность AR-LFAAΔDBD, экспрессируемого с AR-LFAAΔTR, где оба содержали мутации мотива F XX LF. Спасение с помощью MAGE-A11 также было потеряно, когда AR-ядерный транспортный мутант ARΔTRm4 экспрессировался с ARΔDBD или когда два ДНК-связывающих домена, мутанты ARΔTR-C576A и ARΔDBD, были совместно экспрессированы ( B ).

Специфичные для сайта требования к синергетическим эффектам AR и MAGE-A11. A , pCMV-ARΔTR, -ΔDBD, -LFAAΔDBD и / или -LFAAΔTR (25 нг) были экспрессированы в клетках CV1 с ​​0,25 мкг PSA-Enh-Luc и 50 нг pSG5 (-) или pSG5-MAGE. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. На вставке pCMV5 (-) или pCMV-AR WT, ΔTR, LFAAΔTR, ΔDBD или LFAAΔDBD (5 мкг) экспрессировали в клетках COS1. Клетки инкубировали с 10 нМ DHT. Клеточные экстракты (20 мкг белка / полоса) исследовали на трансблоте с использованием антитела AR32. B , pCMV-ARΔDBD, -ΔTR, -ΔTRm4 и / или -ΔTR-C576A (25 нг) экспрессировали в клетках CV1 с ​​0,25 мкг PSA-Enh-Luc и 50 нг pSG5 (-) или pSG5-MAGE ( MAG ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Inset , pCMV5 (-) или pCMV-AR WT или мутанты (5 мкг) были экспрессированы в клетках COS1. Клетки инкубировали с 2 нМ DHT и экстракты (20 мкг белка / полоса) зондировали на трансблотах с использованием антитела AR32. C , top , pCMV-ARΔTR и -ARΔDBD (25 нг) экспрессировали отдельно или вместе с 0,25 мкг PSA-Enh-Luc и 50 нг pSG5 (-) или pSG5-MAGE WT или мутантов. Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Внизу pSG5 (-) или pSG5-MAGE WT или мутанты (8 мкг) были экспрессированы в клетках COS1. Клеточные экстракты (20 мкг белка / полоса) исследовали на трансблоте, используя 0,5 мкг / мл антитела FLAG-MAGE. D , вверху слева и справа , pCMV-ARΔTR и -ARΔDBD (25 нг) были экспрессированы в клетках CV1 с ​​0,25 мкг PSA-Enh-Luc и 50 нг pSG5 (-), pSG5-MAGE WT или мутантов ( слева ), или pSG5-HA-MAGE WT или мутанты ( справа ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Внизу pSG5 (-) или pSG5-HA-MAGE WT или мутанты (8 мкг) были экспрессированы в клетках COS1. Клеточные экстракты (20 мкг белка / полоса) исследовали на трансблотах с использованием антитела HA. Данные в A – D представляют собой среднее значение ± SD ( столбцы ошибок ) и представляют три независимых эксперимента.

Специфичность MAGE-A11 для спасения комплементарных неактивных мутантов AR была продемонстрирована в результате мутаций в сайтах взаимодействия для мотива AR F XX LF ( 4 ), р300 ( 6 ) и TIF2 ( 7 ). Мутации MAGE-A11 сайтов моноубиквитинирования Lys-240 и Lys-245, сайта фосфорилирования Thr-360 Chk1 или остатков гидрофобного F-бокса, которые блокируют взаимодействие MAGE-A11 с AR ( 7 , 14 ) блокировал способность MAGE-A11 спасать трансактивацию с помощью ARΔTR, экспрессируемого ARΔDBD ( C ). Мутация сайта взаимодействия MAGE-A11 для p300 (MAGE-I188A, F189A) ( 6 ) или TIF2 (MAGE-F260A и MAGE-F264A) ( 7 ) устранял синергетический эффект MAGE-A11 на транскрипционную активность с помощью ARΔTR, экспрессируемого ARΔDBD ( D ).

Способность MAGE-A11 спасать трансактивацию комплементарными неактивными мутантами AR свидетельствует о том, что MAGE-A11 увеличивает транскрипционную активность AR путем образования молекулярного мостика между димерами AR. Специфичность была продемонстрирована с использованием мутантов с потерей функции AR F XX LF и мутантов сайтов взаимодействия MAGE-A11 для мотива AR F XX LF или соактиваторов p300 или p160.

MAGE-A11 Ссылки AR Димеры

Способность MAGE-A11 восстанавливать транскрипционную активность комплементарных неактивных AR-мутантов позволяет предположить, что он функционирует как молекулярный мост между AR-димерами. Эта модель подтверждается свидетельством того, что сам MAGE-A11 является димером ( 14 ). FLAG-AR был экспрессирован с помощью ARΔDBD, который мигрирует немного быстрее, чем FLAG-AR, чтобы исследовать влияние MAGE-A11 на формирование комплекса AR. Коиммунопреципитация ARΔDBD с FLAG-AR наблюдалась только в присутствии MAGE-A11 ( A , дорожки 7 и 8 ). ARΔ14–83ΔDBD с делецией области мотивов AR F XX LF ( B ) и AR-LFAAΔDBD с мутацией мотивов AR F XX LF ( C ) не ассоциировались с FLAG-AR в отсутствие или в присутствии MAGE-A11.

MAGE-A11 связывает димеры AR. Пустой вектор FLAG или FLAG-AR (2 мкг) экспрессировали в клетках COS1 с 2 мкг pCMV-ARΔDBD ( A ), pCMV-ARΔ14–83ΔDBD ( B ) или pCMV-AR-LFAAΔDBD ( C ) с или без 2 мкг pSG5-MAGE и 4 мкг pSG5-HA-p300. Клетки инкубировали в присутствии 0,1 мкг / мл EGF с или без 10 нМ DHT. Клеточный экстракт (20 мкг белка на полосу) и иммунопреципитат ( IP ) исследовали с использованием антител AR32, FLAG-MAGE и p300.

Можно ожидать, что транскрипционные последствия MAGE-A11, связывающих димеры AR, будут наиболее очевидными для мультимеризованных ARE. В соответствии с этим, наибольший эффект MAGE-A11 на ARΔTR, коэкспрессированный с ARΔDBD, был замечен с энхансером PSA (PSA-Enh-Luc), который содержит несколько ARE ( 25 ) и с четырехкратным мультимеризованным PSA ARE-1 ​​в PSA-ARE4-Luc ( A ). Влияние MAGE-A11 на ARΔTR и ARΔDBD активацию энхансера PSA было минимизировано путем замены энхансера с высокой аффинностью ARE-III в PSA-Enh-SIII-Luc.

Синергия между AR и MAGE-A11 на нескольких ARE. pCMV-ARΔTR и / или -ARΔDBD (25 нг) экспрессировали в клетках CV1 с ​​50 нг pSG5 (-) или pSG5-MAGE ( M ) и 0,25 мкг pGL3-E4-Luc, PSA-Enh-Luc, PSA- ARE4-Luc и PSA-Enh-SIII-Luc ( A ) или 0,25 мкг PSCA-TATA-Luc или PSCA-ARE4-Luc ( B ). Клетки инкубировали с или без 1 нМ DHT. Данные представляют собой среднее значение ± SD ( столбцы ошибок ) и представляют три независимых эксперимента.

Андрогенно-чувствительный энхансер PSCA в PSCA-TATA-Luc и четырехкратный мультимеризованный PSCA ARE в PSCA-ARE4-Luc ( 26 ) служили дополнительными областями ответа андрогенов, чтобы проверить, можно ли увидеть максимальные эффекты MAGE-A11 для спасения комплементарных неактивных AR-мутантов с мультимеризованными ARE. MAGE-A11 спас транскрипционную активацию PSCA-TATA-Luc с помощью ARΔTR, экспрессируемого с помощью ARΔDBD, где каждый комплементарный неактивный мутант сам по себе имел небольшую активность с или без MAGE-A11 ( B ). Однако наибольший эффект MAGE-A11 был замечен при использовании области мультимеризованного ответа андрогена в PSCA-ARE4-Luc. В этом случае только ARΔTR активировался с помощью MAGE-A11, а MAGE-A11 синергически увеличивал активность ARΔTR, одновременно экспрессируемого с ARΔDBD.

Результаты подтверждают концепцию, что MAGE-A11 увеличивает транскрипционную активность AR, формируя молекулярный мост между AR димерами. Активность MAGE-A11 с мультимеризованными ARE поддерживает модель, в которой синергетические эффекты MAGE-A11 опосредованы мультидимерным комплексом AR · MAGE-A11 ().

Модель синергетических эффектов димеров AR-мостиков MAGE-A11. Димер AR подвергается андроген-зависимому взаимодействию между NH2-концевым мотивом 23F XX LF27 и AF2 в лиганд-связывающем домене. Взаимодействие AR N / C важно для трансактивации AR андроген-зависимых генов ( 67 ). MAGE-A11 образует димер ( 14 ) и взаимодействует через свою F-подобную область с расширенной областью мотива 23F XX LF XX V XX V33 в димере AR. Способность MAGE-A11 восстанавливать транскрипционную активность комплементарных неактивных AR-мутантов, у которых отсутствует функция активации 1 или ДНК-связывающий домен, свидетельствует о том, что MAGE-A11 связывает димеры AR. Эта функция MAGE-A11 поддерживалась коиммунопреципитацией в отличие от димеров AR, для которых требовался MAGE-A11.

Похожие

Комментарии